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ibidi血管生成、侵襲等實驗現(xiàn)象

更新時間:2016-08-24   更新時間:2016-08-24   點擊次數(shù):5002次

卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內(nèi)的多種組織內(nèi)的,具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤??ㄎ鞑ㄈ饬鯧S已經(jīng)被鑒定出多種細胞標記物,但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發(fā)現(xiàn)卡西波肉瘤相關(guān)的皰疹病毒(KSHV)能夠使大鼠的原代間充質(zhì)干細胞(MSCs)感染,變形,并且重新編輯,使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中,科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質(zhì)干細胞,包括骨髓(MSCbm),脂肪組織(MSCa),牙髓,牙齦組織(GMSC),和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa,MSCbm和GMSC(LTC-KMSCs)的穩(wěn)定株。其中,這些細胞表達了混合的KS標記物,并且顯現(xiàn)出不同的血管生成、侵襲和變形的現(xiàn)象,而LTC-KMSCs表現(xiàn)出比未感染細胞更低的增殖率。進而研究人員發(fā)現(xiàn)KSHV介導(dǎo)的血管生成是通過KSHV介導(dǎo)的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明,在人體內(nèi)MSCs是KSHV的靶細胞,會建立起多種KSHV感染的模型。

 

研究人員采用各種MSCs,鋪在基質(zhì)膠上,孵育8小時,對比不同細胞的分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)。

 

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

 

(一)實驗材料和實驗方法

1)細胞:  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2)培養(yǎng)基:      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3)基質(zhì)膠:    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4)耗材:    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506)

5)其他:        細格紙                                  

 

(二)實驗步驟

1)準備基質(zhì)膠

① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中,注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

③ 準備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。

④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。

⑤ 37℃至少孵育30分鐘,使基質(zhì)膠固化。

怎么知道加了合適體積的Matrigel:

由于Matrigel流動性不強,并且有可能移液槍不準確,有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,這樣,必然會影響到實驗的成像結(jié)果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

 

如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

 

 

3)鋪細胞

 

① 每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,充分混勻。

② 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

③ 每孔加入50μl的細胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠?。

④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。

⑤ 蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

 

4)采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果

37度 5% CO2孵育8小時后,使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像,并其分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)進行測量和統(tǒng)計。

 

三)實驗結(jié)果

 

對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質(zhì)干細胞,KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集,100倍放大倍數(shù)。

 

  1. 為了研究KSHV相關(guān)的miRNA的作用,對比了未被感染MSCs(Mock),感染的MSCs(KSHV)和用10個pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs(ΔmiR)和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉(zhuǎn)的MSCs(ΔmiR Vector);以及用逆轉(zhuǎn)錄病毒重新表達這10個miRNA簇(ΔmiR Cluster)這幾組細胞的血管生成。發(fā)現(xiàn)這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制劑,對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升,抑制作用會增強。兩組結(jié)果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數(shù)采集圖像。

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