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在流體環(huán)境下細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn),該應(yīng)用描述了一種在流動下的粘附試驗(yàn),該試驗(yàn)旨在研究特定細(xì)胞表面分子的作用,以確定它們在細(xì)胞附著和粘附到其他細(xì)胞類型期間的潛在相互作用。
實(shí)驗(yàn)流程
1.準(zhǔn)備EOMA細(xì)胞稀釋液:根據(jù)制造商的說明,使用非酶細(xì)胞解離溶液分離先前培養(yǎng)的EOMA細(xì)胞。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Neubauerchamber)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在EC培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至1.2x106個細(xì)胞/ml的濃度?! ?/p>
2.種入EOMA細(xì)胞:在3個 µ-SlidesI0.6mmLuer(ibidi,80186)中加入150µlEOMA細(xì)胞稀釋液(每個µ-Slide1.75x105EOMA細(xì)胞),然后孵育3小時。
表1:實(shí)驗(yàn)設(shè)置
3.啟動流量:播種三小時后,將2個µ-Slides連接到流體單元FU,使用總量2.7毫升EC培養(yǎng)基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細(xì)胞表面的剪切應(yīng)力設(shè)置為0.5dyn/cm2。測量流速并使用兩個FU的平均值來計(jì)算校準(zhǔn)因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個帶有EOMA細(xì)胞的µ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒有任何流動的情況下孵育它過夜。
4.準(zhǔn)備MM細(xì)胞:根據(jù)制造商的方案,用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培養(yǎng)基(不含F(xiàn)CS)中染色6x105MM細(xì)胞。標(biāo)記后,離心細(xì)胞并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。
5.開始與MM細(xì)胞共培養(yǎng):停止流動并在無菌條件下從FU水庫中取出EC培養(yǎng)基。要開始共培養(yǎng),將RPMI培養(yǎng)基(含10%FCS)和EC培養(yǎng)基以1:1的比例混合,并填充該混合物總體積為2.5ml,其中含有1.5x105MM注入兩個FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統(tǒng)并繼續(xù)流動24小時。
6.分子阻斷:將MM細(xì)胞添加到ECs后24小時,用100µg/ml抗體(載玻片 #2)或相應(yīng)的同種型對照(載玻片 #1)處理細(xì)胞,將它們直接添加到FU,無需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動狀態(tài)下24小時。
7.清洗和成像:從FU上斷開µ-Slides。用PBS清洗細(xì)胞一次,以去除任何非貼壁細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像,以可視化附著在EC層上的標(biāo)記MM細(xì)胞。
圖1:與同種型對照處理(左圖)相比,阻斷特定表面分子(右圖)時,MM細(xì)胞對ECs的粘附性降低