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甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTG-1)影響肺癌細(xì)胞血管生成

更新時(shí)間:2016-06-03   更新時(shí)間:2016-06-03   點(diǎn)擊次數(shù):2232次

美國(guó)的科研人員通過(guò)對(duì)TTF-1的調(diào)控發(fā)現(xiàn),TTF-1能直接調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),并且發(fā)現(xiàn)VEGF啟動(dòng)子上有多處TTF-1響應(yīng)序列。 比如,VEGF的主要受體,VRGFR2顯示出收到TTF-1的直接正調(diào)節(jié)。本文中顯示,低氧并沒(méi)有促進(jìn) TTF-1+肺癌細(xì)胞中的VEGF的表達(dá)。而采用外泌體培養(yǎng)基或者是去外泌體的培養(yǎng)基(EDM)時(shí),TTF-1都能促進(jìn)VEGF表達(dá)。但在研究中意外的發(fā)現(xiàn)TTF-1+肺癌細(xì)胞的去外泌體培養(yǎng)基(EDM-TTF-1+)能夠內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成。

研究人員采用HUVECs,鋪在基質(zhì)膠上,加入EDM以及VEGFR1等蛋白質(zhì)后孵育2-3小時(shí),對(duì)比不同條件下的分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

(一)實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1)細(xì)胞:       HUVECs                                 104 cells/50μl
2)培養(yǎng)基:      RPMI
3)基質(zhì)膠:    Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A)    10 µl per well
4) 試劑:     A549 conditioned media (EDM)
             Recombinant human GM-CSF protein(250ng/ml,Peprotech,300-03)
             sVEGFR1 protein(20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1)
             Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215)
             Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321) 
5)耗材:    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506) 
6)其他:        細(xì)格紙                                   
           

(二)實(shí)驗(yàn)步驟
1)準(zhǔn)備基質(zhì)膠
① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中,注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。
② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③ 準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過(guò)水的紙巾,制成一個(gè)濕盒。
④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
⑤ 37℃至少孵育30分鐘,使基質(zhì)膠固化。


怎么知道加了合適體積的Matrigel:
由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng),并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,這樣,必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示,垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒(méi)發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。


3)鋪細(xì)胞

① 在培養(yǎng)好的HUVECs細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入5μg 的 Calcein-AM,染色45分鐘。
② 胰酶消化細(xì)胞制成懸液,每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,充分混勻。
③ 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
④ 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠?。
⑤ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒(méi)有,加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。
⑥ 蓋上蓋,靜置,一段時(shí)間后,所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

4)不同培養(yǎng)基處理
采用EDM-EV,EDM-HDD,EDM-TTF-1處理細(xì)胞,并分別加入 rGM-CSF和rsVEGFR1,以Goat Ab和 Mouse Ab作為對(duì)照。37℃,培養(yǎng)2-3小時(shí)。
5)采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果
使用尼康TS100顯微鏡的40倍鏡采集圖像,并且用 ImageJ對(duì)其分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)。

三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果


如圖所示,使用EDM-TTF1處理的HUVECs血管生成被顯著的抑制。當(dāng)加入GM-CSF和VEGFR1后,血管生成也被顯著的抑制,但當(dāng)加入GM-CSF和VEGFR1的抗體后,血管生成的抑制也被取消,細(xì)胞又顯出很強(qiáng)的血管生成結(jié)果。說(shuō)明TTF-1上調(diào)了GM-CSF和VEGFR1的表達(dá),抑制了血管生成的進(jìn)程。

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